葉綠素a分光光度法操作步驟

葉綠素a分光光度法操作步驟：

將一定量水樣用玻璃纖維濾膜過濾，以90%丙酮為提取液研磨提取水中浮游植物的葉綠素，離心后測定其750nm、664nm、647nm、630nm 波長下的吸光度值，計(jì)算葉綠素a 的含量。

測定葉綠素的具體操作步驟如下：

（1） 過濾：

（2） 研磨：

將樣品濾膜放置于研磨裝置中，加入 3~4mL丙酮溶液，研磨至糊狀。補(bǔ)加3~4mL丙酮溶液，繼續(xù)研磨，并重復(fù)1~2次，保證充分研磨5min以上。將破碎后的細(xì)胞提取液轉(zhuǎn)移至玻璃刻度離心管中，用丙酮溶液沖洗研缽及研磨杵，一并轉(zhuǎn)移入離心管中，定容至10Ml。

（3） 浸泡提取：

將離心管中的研磨提取液充分震蕩混勻后，用鋁箔包好，放置于4攝氏度下避光浸泡提取2小時(shí)以上。

（4） 離心：

將離心管放入離心機(jī)，以3000~4000r/min的速度離心10min，然后用針式濾器過濾上清液得到葉綠素a的丙酮提取液待測。

（5） 空白試樣的配置：

用實(shí)驗(yàn)用水按照與試樣的制備相同的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白試樣的制備。

（6） 測定：

將試樣轉(zhuǎn)移至比色皿中，以丙酮溶液為參比溶液，于波長750nm、664nm、647nm、630nm處測吸光度。

國內(nèi)外方法中的各種實(shí)驗(yàn)條件總結(jié)如下：

（1）提取試劑：

除熱乙醇方法，國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)方法均采用90%丙酮作為提取試劑。EPA446.0 指出，90%丙酮溶液可以有效提取大部分藻類細(xì)胞中的葉綠素a，而且不產(chǎn)生其它衍生物。丙酮是國際上提取葉綠素的試劑。

（2）濾膜：

除《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》采用乙酸纖維濾膜外，均采用玻璃纖維濾膜。

（3）樣品保存方法：

樣品的保存條件各種方法略有不同，但水樣采集后均保證4℃冷藏保存，樣品濾膜可冷凍保存。而且葉綠素a 測定樣品濾膜冷凍后再研磨，可提高提取效率。如采樣后不立刻測定，-18℃下冰凍，再于室溫條件下融解，利用細(xì)胞內(nèi)冰粒的形成和細(xì)胞液濃度的增高引起溶漲，使胞壁結(jié)構(gòu)破碎引起葉綠素溶出。

（4）是否研磨及研磨后是否需要浸泡：

目前國內(nèi)也有很多文獻(xiàn)報(bào)道了對上述葉綠素a提取方法的改進(jìn)研究，如延長提取時(shí)間。水利部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《葉綠素a的測定分光光度法》（SL88-2012）葉綠素測定的主要操作是低溫反復(fù)冷凍提取-避光冷藏浸泡-離心，在EPA的446.0的基礎(chǔ)上改進(jìn)了提取方法?？紤]到不同地區(qū)儀器設(shè)備的能力差異，-40℃的超低溫冰箱不是所有的環(huán)境監(jiān)測部門均具備的儀器設(shè)備，所以將樣品濾膜的冷凍作為輔助的提取條件。

（5）計(jì)算公式及波長：

關(guān)于計(jì)算方法，主要有三色法和單色法，三色法主要考慮了葉綠素b 和葉綠素c 對測定的干擾，測定的是表觀葉綠素a 的含量（包括葉綠素a 與脫鎂葉綠素a 之和），單色法考慮脫鎂葉綠素a 的干擾.從方法的簡便性來說，三色法操作簡單，產(chǎn)生誤差幾率小，耗時(shí)比單色法短。